常見問題

分子腫瘤學

問題：在做融合檢測時，為什麽使用RNA比使用DNA更好？

回答：

為什麽Archer FusionPlex檢測使用RNA替代DNA作為輸入材料？所有這些都歸因於生物相關性、成本及測試需時。基因易位可以發生在基因組的任何地方，包括內含子 (intron) 和其他非編碼序列。也可以發生在表達模式有限的基因編碼區域內。這意味著許多發生在細胞內的易位可能無法表達，因此，幾乎沒有生物學意義。所以DNA不是尋找致癌融合的理想基質。而另一方面，因為只需要檢測可以表達的潜在致癌基因，RNA是基因表達的中間産物，是融合檢測的理想基質。在基因組非編碼區域尋找易位是費時且昂貴的。例如，基於DNA的混合捕獲技術可以覆蓋內含子區域，這可能是重複的、容易産生均聚物，並且跨度為100kb或更多。這種方法需要更多的探針、測序儀上更多的空間和更多的輸入材料。即便如此，覆蓋範圍也可能參差不齊。另一方面，FusionPlex檢測使用RNA轉錄本，並將基因特異性引物放置在已知融合斷點附近，這樣就可以用一個引物識別易位。由於FusionPlex檢測結合了多個靶向融合的引物，因此可以用更少的reads 和輸入材料有效地檢測出更多的融合。FusionPlex檢測使用RNA檢測融合，比基於DNA的混合捕獲技術更好、更快、更便宜，以Archer的方式及眾多FusionPlex檢測方法之一檢測融合。

問題：運行Illumina®測序時，集群密度應該是多少？

回答：

預期的集群密度將隨儀器類型和試劑不同而變化。詳見下表。有關完整的文庫變性和加載說明，請參閱相關試劑的特定方案。

Instrument	Kit	Expected Cluster Density
HiSeq®	High Output, TruSeq v3 High Output, TruSeq v4 Rapid, v2	750-850 k/mm2 950-1050 k/mm2 850-1000 k/mm2
MiSeq®	v2 v3	1000-1200 k/mm2 1200-1400 k/mm2
MiniSeq®	Mid & High Output	170-220 k/mm2
NextSeq®	Mid & High Output, v2	170-220 k/mm2

Please refer to your kit-specific protocol for complete library denaturation and loading instructions.

問題：多少個Archer®樣本可以混合在一起？

回答：

混合的程度取决於目標數量和每次運行時儀器産生的讀取數量 (reads)。這將根據目錄分組及定制分組的不同而變化。需要優化定制融合檢測，以平衡所需讀取數量和混合程度。

Archer® Illumina® or Ion Torrent™ FusionPlex™ Panels

Archer Illumina or Ion Torrent Panel	Input Material	Applications	# of Genes	# of Targets/Assay	Recommended # of Reads
Archer FusionPlex ALK, RET, ROS1 Panel v2	RNA/TNA	Fusions/SNVs	3	29	1,000,000
Archer FusionPlex Heme v2 Panel	RNA/TNA	Fusions	87	607	1,500,000
Archer FusionPlex NTRK Panel	RNA/TNA	Fusions	3	25	1,000,000
Archer FusionPlex Sarcoma Panel	RNA/TNA	Fusions	26	148	1,500,000
Archer FusionPlex Solid Tumor Panel	RNA/TNA	Fusions/SNV's	53	290	3,000,000
Archer FusionPlex Lung Thyroid Panel	RNA/TNA	Fusions	8	42	1,500,000
Archer FusionPlex CTL Panel	RNA/TNA	Fusions/SNVs/Expression	35	195	1,500,000
Archer FusionPlex Oncology Research Panel	RNA/TNA	Fusions	74	393	3,000,000
Archer FusionPlex ALL Panel	RNA/TNA	Fusions	81	506	1,500,000
Archer FusionPlex ALL Panel	RNA/TNA	Fusions	84	507	1,500,000
Archer FusionPlex Pan-Heme Panel	RNA/TNA	Fusions	199	1054	4,500,000
Archer FusionPlex Lymphoma Panel	RNA/TNA	Fusions	125	716	2,000,000

Archer® Illumina® VariantPlex™ Panels

Archer Illumina Panel	# of Targets/Assay	Recommended # of Reads
VariantPlex Solid Tumor Panel	660	2,000,000-3,000,00
VariantPlex p53 Panel	23	100,000
VariantPlex CTL Panel	290	1,000,000
VariantPlex Core AML Panel	105	750,000
VariantPlex BRCA1/2 Panel	23	500,000

問題：Archer檢測的平均擴增子長度是多少?

回答：

FusionPlex Assays

從Bioanalyzer 的記錄來看，擴增子的預期平均尺寸在150到400個碱基對之間。然而，當使用KAPA Biosystems 文庫定量試劑盒進行實時定量基因擴增熒光檢測（qPCR）時，應假設平均片段長度為200個碱基對。我們推薦的稀釋液和MiSeq®和PGM®輸入量均基於200個碱基對的假設平均片段長度。有關指導，請參閱特定方案。

VariantPlex Assays

從Bioanalyzer 的記錄來看，擴增子的預期平均尺寸在150到400個碱基對之間。然而，當使用KAPA Biosystems 文庫定量試劑盒進行實時定量基因擴增熒光檢測（qPCR）時，應假設平均片段長度為250個碱基對。我們根據分組推薦的稀釋液和MiSeq®和PGM®輸入量均基於250個碱基對的假設平均片段長度。有關指導，請參閱特定方案。

問題：在使用Archer FusionPlex和VariantPlex檢測進行文庫製備之前，我的輸入材料支持哪些提取方法？

回答：

對於以下所有提取方法，我們推薦以下洗脫緩衝液及定量和質量控制方法：

推薦洗脫緩衝液	定量方法	推薦質量
無核酸酶水	- Qubit^® RNA HS 檢測試劑盒 (Life Technologies^® Q32852) for FusionPlex - Qubit^® HS dsDNA (Life Technologies^® Q32851) for VariantPlex	- Archer^® PreSeq^™ RNA QC Assay (AK0043-16) for FusionPlex^® - Archer^® PreSeq^™ DNA QC Assay (AK0067-16) for VariantPlex^™

從石蠟（FFPE）組織中提取總核酸

建議提取方法	提取試劑盒建議
Agencourt^® FormaPure^®	- 不要使用 DNase處理。 - 使用加熱器 (heat block) 而 - 在第5步中，在55°C消化一. - 步驟5和步驟6之間，在 - 在步驟23中，在40μL無
Promega ReliaPrep^™ FFPE 總 RNA 微量製備系統 (Z1001)	-將解交聯步驟在80°C延長.
Maxwell RSC RNA FFPE Kit (AS1440)	- 不要使用 DNase 處理。直接從室溫下.

新鮮冷凍組織（Fresh Frozen），細胞系和血液

建議提取方法

任何總RNA（用於FusionPlex）或DNA（用於VariantPlex)

問題：在NGS文庫中保留特定信息的好處是什麽?

回答：

腫瘤標本通常保存為FFPE樣本。不幸的是，福爾馬林固定常導致碱基脫胺基，造成測序假影。例如，負鏈上的胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶。在傳統的反向引物富集法中，尿嘧啶被轉錄成腺嘌呤，並在PCR過程中被擴增。由於擴增發生在任何類型的接頭加入擴增子之前，因此鏈的特異性丟失，序列分析將導致假陽性C到T單核苷酸變異。另一方面，因為分子條碼接頭在擴增之前連接到DNA，基於PCR的Anchored Multiplex富集可以識別這些脫胺基情况。結合鏈特異性引物，AMP在序列分析過程中保持了區分正鏈和負鏈讀數的能力。因此，在所有負鏈上檢測到的相同的C到T轉變清楚地表明假陽性SNV，因此不稱為突變。我們來看看實際的測序數據。如果這些數據來自反向引物富集，則FFPE篩選中C至T轉換的普遍性將表明NRAS G13D變異在非小細胞肺癌中普遍存在。但是因為AMP保留了鏈的特異性，所以所有的C到T轉換都是在負鏈上檢測到的，這以極高的統計可信度表明，這實際上是一種FFPE脫胺反應。Anchored Multiplex PCR優於傳統的反向引物，因為鏈特異性使您可以識別和糾正脫胺事件，否則將導致假陽性結果。

問題. AMP是否比其他文庫製備方法更適合新型融合檢測？

回答：

導致腫瘤和疾病發生的突變以各種形式出現，包括基因融合，可以通過測序融合轉錄本來識別和表徵基因融合。傳統的基於反向引物的文庫製備方法需要確定待測序區域的靶向引物和融合特定引物。擴增後，將接頭連接到DNA上進行進一步的擴增和測序。以這種方式檢測融合的問題是，您需要位於目標區域和融合夥伴側翼的引物，因此只能檢測到已知的融合。Anchored Multiplex PCR使您能夠檢測感興趣的目標，以及任何已知和未知的融合夥伴。這是因為AMP使用靶向特異性的單向引物以及反向引物，這些引物與測序接頭雜交，在擴增前連接到每個片段。使用這種方法，您的靶向區域，加上任何已知的或新的融合夥伴，被選擇性地放大以進行測序。通過消除由於新變異或融合而導致的假陰性，提高了融合試驗的分析靈敏度。