经常问的问题

分子肿瘤学

问题：在做融合检测时，为什么使用RNA替代DNA更好？

回答：

为什么Archer FusionPlex检测使用RNA替代DNA作为输入材料？所有这些都归结于生物相关性、成本及转化时间。基因易位可以发生在基因组的任何地方，包括内含子和其他非编码序列。也可以发生在表达模式有限的基因编码区域内。这意味着许多发生在细胞内的易位可能无法表达，因此，几乎没有生物学意义。所以DNA不是寻找致癌融合的理想基质。而另一方面，因为只需要检测可以表达的潜在致癌基因，RNA是基因表达的中间产物，是融合检测的理想基质。在基因组非编码区域寻找易位是费时且昂贵的。例如，基于DNA的混合捕获技术可以覆盖内含子区域，这可能是重复的、容易产生均聚物，并且跨度为100kb或更多。这种方法需要更多的探针、测序器上更多的空间和更多的输入材料。即便如此，覆盖范围也可能参差不齐。另一方面，FusionPlex检测使用RNA转录本，并将基因特异性引物放置在已知融合断点附近，这样就可以用一个引物识别易位。由于FusionPlex检测结合了多个靶向融合的引物，因此可以用更少的读取和输入材料有效地检测出更多的融合。FusionPlex检测使用RNA检测融合，比基于DNA的混合捕获技术更好、更快、更便宜，以Archer的方式及众多FusionPlex检测方法之一检测融合。

问题：Illumina®测序运行时，集群密度应该是多少？

回答：

预期的集群密度将随仪器类型和试剂盒不同而变化。详见下表。

Instrument	Kit	Expected Cluster Density
HiSeq®	High Output, TruSeq v3 High Output, TruSeq v4 Rapid, v2	750-850 k/mm2 950-1050 k/mm2 850-1000 k/mm2
MiSeq®	v2 v3	1000-1200 k/mm2 1200-1400 k/mm2
MiniSeq®	Mid & High Output	170-220 k/mm2
NextSeq®	Mid & High Output, v2	170-220 k/mm2

有关完整的库变性和加载说明，请参阅试剂盒特定方案。

问题：多少个Archer®样本可以复合在一起？

回答：

多路复用的程度取决于目标数量和每次运行时仪器产生的读取数量。这将根据目录分组及定制分组的不同而变化。需要优化定制融合检测，以平衡所需读取数量和复用程度。

Archer® Illumina® or Ion Torrent™ FusionPlex™ Panels

Archer Illumina or Ion Torrent Panel	Input Material	Applications	# of Genes	# of Targets/Assay	Recommended # of Reads
Archer FusionPlex ALK, RET, ROS1 Panel v2	RNA/TNA	Fusions/SNVs	3	29	1,000,000
Archer FusionPlex Heme v2 Panel	RNA/TNA	Fusions	87	607	1,500,000
Archer FusionPlex NTRK Panel	RNA/TNA	Fusions	3	25	1,000,000
Archer FusionPlex Sarcoma Panel	RNA/TNA	Fusions	26	148	1,500,000
Archer FusionPlex Solid Tumor Panel	RNA/TNA	Fusions/SNV's	53	290	3,000,000
Archer FusionPlex Lung Thyroid Panel	RNA/TNA	Fusions	8	42	1,500,000
Archer FusionPlex CTL Panel	RNA/TNA	Fusions/SNVs/Expression	35	195	1,500,000
Archer FusionPlex Oncology Research Panel	RNA/TNA	Fusions	74	393	3,000,000
Archer FusionPlex ALL Panel	RNA/TNA	Fusions	81	506	1,500,000
Archer FusionPlex ALL Panel	RNA/TNA	Fusions	84	507	1,500,000
Archer FusionPlex Pan-Heme Panel	RNA/TNA	Fusions	199	1054	4,500,000
Archer FusionPlex Lymphoma Panel	RNA/TNA	Fusions	125	716	2,000,000

Archer® Illumina® VariantPlex™ Panels

Archer Illumina Panel	# of Targets/Assay	Recommended # of Reads
VariantPlex Solid Tumor Panel	660	2,000,000-3,000,00
VariantPlex p53 Panel	23	100,000
VariantPlex CTL Panel	290	1,000,000
VariantPlex Core AML Panel	105	750,000
VariantPlex BRCA1/2 Panel	23	500,000

问题：Archer检测的平均扩增子长度是多少?

回答：

FusionPlex Assays

从生物分析仪的记录来看，扩增子的预期平均尺寸在150到400个碱基对之间。然而，当使用KAPA Biosystems 文库定量试剂盒进行实时定量基因扩增荧光检测（qPCR）时，应假设平均片段长度为200个碱基对。我们推荐的稀释液和MiSeq®和PGM®输入量均基于200个碱基对的假设平均片段长度。有关指导，请参阅特定方案。

VariantPlex Assays

从生物分析仪的记录来看，扩增子的预期平均尺寸在150到400个碱基对之间。然而，当使用KAPA Biosystems 文库定量试剂盒进行实时定量基因扩增荧光检测（qPCR）时，应假设平均片段长度为250个碱基对。我们根据分组推荐的稀释液和MiSeq®和PGM®输入量均基于250个碱基对的假设平均片段长度。有关指导，请参阅特定方案。

问题：在使用 Archer FusionPlex 和 VariantPlex 检测进行文库制备之前，我的输入材料支持哪些提取方法？

回答：

对于以下所有提取方法，我们推荐以下洗脱缓冲液及定量和质量控制方法：

推荐洗脱缓冲液	计量方法	推荐质量检查步骤
无核酸酶水	- 用于用于FusionPlex的 Qubit® RNA HS 检测试剂盒(Life Technologies® Q32852 - 用于VariantPlex 的Qubit® HS dsDNA (Life Technologies®Q32851	- Archer^® PreSeq^™ RNA QC Assay (AK0043-16) for FusionPlex^® - Archer^® PreSeq^™ DNA QC Assay (AK0067-16) for VariantPlex^™

从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取总核酸

建议提取方法	提取试剂盒建议
Agencourt^® FormaPure^®	- 不要使用 DNase处理。 - 使用热阻而不是水浴。 - 在第5步中，在55°C消解一小时，不 - 步骤5和步骤6之间，在80°C下培养 - 在步骤23中，在40μL无核酸酶水中洗脱样品
Promega ReliaPrep^™ FFPE 总 RNA 微量制备系统(Z1001)	- 将反向交联步骤在80°C延长至1
Maxwell RSC RNA FFPE Kit (AS1440)	- 不要使用 DNase 处理。直接从室温下

新鲜冷冻组织（FF），细胞系和血液

建议提取方法

任何总RNA（用于FusionPlex）或DNA（用于VariantPlex)

问题：在 NGS 库中保留特定信息的好处是什么?

回答：

肿瘤标本通常保存为FFPE样本。不幸的是，福尔马林固定常导致碱基脱胺基，造成测序伪影。例如，负链上的胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶。在传统的反向引物富集法中，尿嘧啶被转录成腺嘌呤，并在PCR过程中被扩增。由于扩增发生在任何类型的接合器加入扩增子之前，因此链的特异性丢失，序列分析将导致假阳性C到T单核苷酸变异。另一方面，因为分子条形码适配器在扩增之前连接到DNA，基于PCR的Anchored Multiplex富集可以识别这些脱胺基情况。结合链特异性引物，AMP在序列分析过程中保持了区分正链和负链读数的能力。因此，在所有负链上检测到的相同的C到T转变清楚地表明假阳性SNV，因此不称为突变。我们来看看实际的测序数据。如果这些数据来自反向引物富集，则FFPE筛选中C至T转换的普遍性将表明NRAS G13D变异在非小细胞肺癌中普遍存在。但是因为AMP保留了链的特异性，所以所有的C到T转换都是在负链上检测到的，这以极高的统计可信度表明，这实际上是一种FFPE脱胺反应。Anchored Multiplex PCR优于传统的反向引物，因为链特异性使您可以识别和纠正脱胺事件，否则将导致假阳性结果。

问题. AMP是否比其他文库制备方法更适合新型融合检测？

回答：

导致肿瘤和疾病发生的突变以各种形式出现，包括基因融合，可以通过测序融合转录本来识别和表征基因融合。传统的基于反向引物的文库制备方法需要确定待测序区域的靶向引物和融合特定引物。扩增后，将适配器连接到DNA上进行进一步的扩增和测序。以这种方式检测融合的问题是，您需要位于目标区域和融合伙伴侧翼的引物，因此只能检测到已知的融合。Anchored Multiplex PCR使您能够检测感兴趣的目标，以及任何已知和未知的融合伙伴。这是因为AMP使用靶向特异性的单向引物以及反向引物，这些引物与测序适配器杂交，在扩增前连接到每个片段。使用这种方法，您的靶向区域，加上任何已知的或新的融合伙伴，被选择性地放大以进行测序。通过消除由于新变异或融合而导致的假阴性，提高了融合试验的分析灵敏度。